1、 為何完成圖選擇三代測序平臺？

受測序片段長度的限制，細菌基因組序列通常需要利用軟件算法將大量測序片段拼接起來，而細菌基因組中重復序列的存在，則會大大增加拼接的復雜度。細菌重復序列的大小從幾百bp到7 Kb不等，細菌框架圖的插入片段，只能解決少量的重復片段問題，因此組裝結果更加碎片化；細菌精細圖采用了6 Kb大片段文庫，可以跨過絕大部分重復序列，并將結果Scaffold控制在30條以內；而三代測序采用了10 Kb文庫，平均讀長也達到10 Kb以上，由于序列夠長，避免了細菌基因組中重復序列的影響，因此能夠獲得0 gap的完整組裝結果。

2、 對于細菌基因組測序，三代和二代測序相比有何優勢？

三代測序的優勢在于讀長長，準確度高，GC含量影響小，而劣勢是測序成本偏高。對于細菌基因組測序來說，三代測序的讀長長可以解決細菌中的重復序列問題，也避免了異常GC菌株的測序不均勻問題。由于細菌基因組較小，需要的測序量不大，對于較為精細的細菌完成圖來說，三代成本甚至低于二代結合一代的策略。隨著三代測序通量提升和成本降低，未來三代測序有望在細菌基因組領域獲得更廣泛的應用。

3、 群體進化分析，對于參考基因組選擇有什么要求？

研究多個菌株之間的起源關系和進化順序，可以選擇這些菌株之間的單拷貝核心基因作為遺傳標記，構建物種進化關系，以此為基礎進行分歧時間、地域傳播、選擇壓力等相關研究。一般來說，選擇的基因組間親緣關系越遠，單拷貝核心基因的數目也就越少。如果單拷貝核心基因的數目低于一定限度，如數百個基因以下，則進化樹的精度會受到影響。以典型的應用場合為例，可以選擇5株左右同一屬的菌株，再額外選擇2株左右臨近屬的菌株作為外群，總共5~8株菌株用于構建進化樹。

4、 基于共線性分析檢測得到菌株變異，應該如何解讀？

基于共線性分析檢測，可以得到目標菌株不同類型的變異，一般按照變異對蛋白序列的影響嚴重程度，優先關注影響較大的基因。一般可參考如下順序：基因插入缺失>導致移碼突變的InDel>非移碼InDel≈非同義SNP>同義SNP。其中基因插入缺失，特別是新基因的插入，通過重測序手段往往難以檢測到。這也是為什么我們更推薦基于組裝結合比較基因組手段檢測變異的原因之一。