寶“剪”鋒從磨礪出！CRISPR的問世確實帶來了基因編輯的黃金時代，編輯人類胚胎、闖入臨床研究、“霸屏”CNS，每一項都足以振奮人心。而2017年CRISPR似乎更具魔力，它以前所未有的精度，可對各種生物體的DNA做出微調。如今，年終盤點季，帶領大家一起回顧一下“魔剪”CRISPR技術在過去一年的“豐功偉績”。
CRISPR的新玩法——微調DNA
1.不切DNA，照樣也能治疾病
美國沙克生物研究所的研究者開發出一種新型CRISPR-Cas9系統，能在不切開DNA的前提下，對基因進行激活。他們將Cas9酶表達基因插入一個腺相關病毒（AAVs）的同時，利用另一個AAV引入短sgRNA和轉錄激活劑。sgRNA只有14或15個核苷酸，可阻止Cas9切割DNA，并促使其與轉錄激活劑協同作用。
值得一提的是，該系統在多種疾病小鼠模型中實現了“疾病逆轉”，如急性腎臟疾病小鼠模型、1型糖尿病小鼠模型和肌肉萎縮癥小鼠模型。這也證實了新CRISPR技術是安全的，不會產生不想要的基因突變。
參考文獻：In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation (DOI:10.1016/j.cell.2017.10.025)
2.自由替換DNA堿基，精準打靶
2016年，哈佛研究者成功利用CRISPR技術將DNA的C轉化為U，即實現了C?G堿基對向T?A堿基對的轉換。而今年同一個研究團隊再次開發出了“新堿基編輯器”ABE（Adenine Base Editor）實現了C?G向T?A的轉換。
簡單來說，就是一種改造后的TadA酶，將靶DNA鏈中的腺嘌呤（A）轉換為肌苷（I，I可起到類似鳥嘌呤G的作用），然后“誘騙”細胞修復另一條DNA鏈以完成堿基對的轉換。研究者利用該技術成功逆轉了與遺傳學血色病相關的G-to-A突變。
參考文獻：Programmable base editing of A?T to G?C in genomic DNA without DNA cleavage (DOI: 10.1038/nature24644)
3.設置“關閉開關”，更好駕馭CRISPR
為了避免CRISPR誤傷友軍，Doudna教授團隊則通過兩種anti-CRISPR蛋白（ACR）——AcrIIC1 和AcrIIC3，以不同的策略來抑制Cas9酶。前者可直接結合到Cas9酶保守的HNH催化域來阻止多種不同Cas9同源DNA切割；后者通過誘導了Cas9的二聚化來阻止Cas9綁定靶向DNA。
另外，他們還發現升級版Cas9蛋白（如eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1）之所以能實現更精準的DNA切割，是因為其負責感知靶向結合準確性的REC3域發生了突變，使得它們結合非靶目標時，更不容易激活它的“剪刀作用”。
參考文獻：A Broad-Spectrum Inhibitor of CRISPR-Cas9 (DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.07.037)
挖掘新技能，CRISPR“瞄上了”RNA
既然CRISPR已將DNA納入囊中，又怎會放過DNA的“近鄰”RNA呢。近期，CRISPR家族就已經磨刀霍霍向RNA了。
1.搶RNAi飯碗，編輯RNA
張鋒研究團隊測試了來自15種不同微生物的Cas13a（C2c2酶），最終發現LwaCas13a可比以前的RNA敲低工具（RNAi）更強的特異性在靶RNA上切割特定位點，脫靶效應低。另外，他們還找到了Cas13的“死亡變體”，即能結合RNA，卻不能進行切割作用。且該版本的Cas13可通過結合熒光標記來追蹤RNA的軌跡。
參考文獻：RNA targeting with CRISPR–Cas13 (DOI:10.1038/nature24049)
2.篩選lncRNA，CRISPR更方便
研究者研發一種基因組規模的CRISPR-Cas9激活篩選，能夠靶向超過10000 lncRNA轉錄起始點，以識別影響表型的非編碼位點。結果發現有11個lncRNA位點，通過招募激活劑在人類黑色劉細胞中調節對BRAF抑制劑的耐藥性；且大多數候選位點均可調節附近的基因。
因而研究可以通過這一篩選工具，系統性的發現非編碼嗎位點的功能，并闡明它們在基因調控和細胞功能中的多種作用。
參考文獻：Genome-scale activation screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighbourhood (DOI:10.1038/nature24009)
3.首次證實circRNA與大腦息息相關
Cdr1as是哺乳動物大腦中高表達的一種環狀RNA，因其從DNA反義鏈轉錄而來，沒有良好表達的線性等價物，導致其相關功能的分析缺失。
研究者在發現Cdr1as可以和miR-7、miR-671均結合后，則利用CRISPR-Cas9選擇性刪除了小鼠中的Cdr1as基因，結果發現miR-7的水平下調了，miR-671的水平上調了。而且Cdr1as敲除小鼠中與大腦活性相關的“即刻早期基因”（如Fos，且很多為miR-7靶標）的表達發生了變化，而小鼠也表現除了異常的神經元活動。
參考文獻：Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function (DOI:10.1126/science.aam8526)?